Kỹ thuật QF-PCR được được áp dụng phổ biến nhất trong chẩn đoán các bất thường nhiễm sắc thể thường gặp một cách nhanh chóng. Bài viết sau đây sẽ cung cấp đến quý độc giả các thông tin cần biết về kỹ thuật này.
1. Kỹ thuật QF-PCR là gì?
Quantitative Fluorescent Polymerase Chain Reaction (QF-PCR) (PCR huỳnh quang bán định lượng) là một kỹ thuật chẩn đoán được sử dụng để phát hiện bất thường nhiễm sắc thể thường gặp, đặc biệt là trong xét nghiệm trước sinh với thời gian nhanh chóng.
2. Nguyên lý của kỹ thuật QF-PCR
QF-PCR liên quan đến việc khuếch đại các vùng DNA cụ thể bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Phát hiện và phân tích các vùng của NST quan tâm (13, 18, 21, X, Y) có chứa các marker lặp lại song song ngắn (STR) và các marker không đa hình. Các mồi gắn nhãn huỳnh quang được sử dụng để khuếch đại các marker đặc trưng cho nhiễm sắc thể. Do đó, số lượng và tỷ lệ đỉnh huỳnh quang tương ứng với mỗi điểm đánh dấu STR cho biết số lượng bản sao của mỗi NST trong mẫu.
3.Quy trình thực hiện
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị mẫu nên được thực hiện phù hợp, chỉ chuẩn bị một mẫu tại một thời điểm để giảm thiểu nguy cơ lẫn mẫu. Có thể phân tích mẫu DNA của mẹ để xác nhận mẫu hoặc làm lại xét nghiệm lần 2 trên mẫu ban đầu.
- Mẫu dịch ối (AF): 0,5-4ml được sử dụng.
- Mẫu gai nhau (CVS): Mẫu được phân tách từ gai rau có nguy cơ đại diện cho cả nguyên bào nuôi và trung bì, cần xử lý loại bỏ lớp lá nuôi hợp bào (syncytiotrophoblast) để giảm thiểu nguy cơ chẩn đoán sai do khảm gai nhau giới hạn.
- Mẫu máu (mẹ/thai nhi).
Bước 2: Tách chiết DNA
DNA được tách từ mẫu máu toàn phần, mẫu ối hoặc mẫu sinh thiết gai rau. Đảm bảo lượng mẫu đầu vào đủ để phân tích theo yêu cầu của kit xét nghiệm.
Bước 3: Khuếch đại DNA
QF-PCR sử dụng các đoạn mồi cụ thể được thiết kế để nhắm mục tiêu các vùng quan tâm cụ thể trên các nhiễm sắc thể khác nhau. Những đoạn mồi này được dán nhãn bằng tín hiệu huỳnh quang. Phản ứng PCR khuếch đại các vùng DNA mục tiêu, tạo ra nhiều bản sao của các đoạn DNA. Không cần tinh sạch DNA sau phản ứng.
Bước 4: Phân tích đoạn
Các đoạn DNA khuếch đại được tách ra và phân tích bằng điện di mao quản trên hệ thống máy giải trình tự ABI hoặc phương pháp phù hợp khác. Tín hiệu huỳnh quang trên các đoạn DNA cho phép phát hiện và định lượng chúng. Bằng cách so sánh kích thước và số lượng của các đoạn DNA với một tham chiếu, có thể xác định được sự hiện diện hay vắng mặt của bất thường nhiễm sắc thể.
4. Phân tích kết quả QF-PCR
Có thể sử dụng chiều cao, diện tích của các đỉnh (peak) để xác định tỷ lệ allen. Các STR đa dạng về kích thước giữa các đối tượng, tùy thuộc vào số lượng lặp lại bốn (tetra repeat) trên mỗi alen. DNA được khuếch đại từ các đối tượng bình thường dị hợp tử ở một marker STR đặc trưng dự kiến sẽ biểu diễn hai đỉnh có độ dài khác nhau với cùng diện tích.
Lưu ý: Phạm vi bình thường cho tỷ lệ allen không được vượt quá 0,8-1,4. Tuy nhiên, đối với các alen cách nhau hơn 24bp, tỷ lệ alen lên tới 1,5 là chấp nhận được.
Đối với NST thường:
Trái ngược với các STR marker dị hợp được coi là có thông tin, ở trường hợp 1 peak trong đồng hợp tử hoặc monosomy được coi là không có thông tin. Khi tỷ lệ các peak xác nhận đối với ít nhất 2 STR đặc trưng cho NST là đủ để đưa ra chẩn đoán:
Dị hợp tử cho tỷ lệ 1:1
Ba allen được thể hiện rõ bằng ba đỉnh theo tỷ lệ 1:1:1 hoặc hai allen theo tỷ lệ 2:1/1:2.
Các giá trị từ 0,45 đến 0,65 và từ 1,8 đến 2,4 xác định là phạm vi xét nghiệm cho allen trong đó hai trong số ba allen có cùng kích thước.
Đối với NST giới tính:
Có thể sử dụng marker đếm số lượng NST X (khảo sát các trình tự xuất hiện trên NST X và NST thường được khuếch đại khi dùng mồi giống nhau) (a) hoặc các marker không đa hình (AMEL trên NST X; AMEL và SRY trên NST Y) để xác định sự hiện diện hay có mặt NST Y (b).
Phát hiện khảm: việc phát hiện khảm ở mức độ thấp thể hiện bằng độ lệch tinh tế giữa các peak và/hoặc sự hiện diện của các đỉnh phụ nhỏ
Trường hợp nhiễm mẫu mẹ (tỷ lệ allen không xác định) có thể xác nhận bằng cách phân tích mẫu của người mẹ hoặc xác định giới tính nếu thai nhi là nam.
 |
 |
5. Ưu điểm, giới hạn
5.1. Ưu điểm
- Thời gian trả kết quả nhanh: Đa số các phòng xét nghiệm có thể trả kết quả trong 2-3 ngày, sớm nhất có thể trong vòng 6h thay vì có thể lên đến vài tuần như các xét nghiệm chẩn đoán khác như karyotyping hoặc phân tích microarray nhiễm sắc thể (CMA).
- Chi phí hợp lý: QF-PCR thường tiết kiệm chi phí hơn so với CMA, karyotyping. Nó liên quan đến một phân tích mục tiêu của các vùng nhiễm sắc thể cụ thể, giúp giảm chi phí tổng thể của thử nghiệm.
- Tỷ lệ dương tính giả thấp.
- Khả năng xác định các dòng tế bào khác: Khảm tế bào và nhiễm mẫu mẹ.
5.2. Giới hạn
- Độ phân giải và phạm vi khảo sát: QF-PCR chủ yếu được sử dụng để phát hiện các bất thường nhiễm sắc thể phổ biến, chẳng hạn như thể ba nhiễm sắc thể 21, 18 và 13, cũng như một số bất thường nhiễm sắc thể giới tính. Khác với CMA, có thể phát hiện những bất thường di truyền nhỏ hơn trên toàn bộ bộ gen và Karyotyping cung cấp một cái nhìn toàn diện về các nhiễm sắc thể nhưng có độ phân giải thấp hơn so với cả QF-PCR và CMA. Thực chất kích thước các đoạn được khuếch đại trong QF-PCR nằm trong khoảng từ vài chục đến vài trăm bp, tuy nhiên không được thiết kế để phát hiện các cặp bazơ cụ thể hoặc các biến thể trình tự trong DNA, mà mục đích chính chủ yếu cung cấp thông tin về sự hiện diện hay vắng mặt của các bất thường nhiễm sắc thể cụ thể.
- Do chỉ khảo sát các markers tại vài vị trí trên nhiễm sắc thể, do đó QF-PCR không giúp xác định mất/lặp đoạn NST, đột biến gen.
- Cần xác nhận lại nếu kết quả QF-PCR cho thấy khả năng xảy ra bất thường về nhiễm sắc thể, thì có thể khuyến nghị xét nghiệm xác nhận thêm như CMA hoặc karyotyping. CMA cung cấp một phân tích toàn diện hơn về các bất thường di truyền, bao gồm cả những thay đổi nhỏ từ vài kb, trong khi karyotyping cung cấp một cái nhìn chi tiết về các nhiễm sắc thể nhưng bị hạn chế về khả năng phát hiện các biến thể di truyền nhỏ hơn (thường từ 6-10Mb trở lên mới có thể phát hiện.
- Khảm thấp khó phát hiện trên QF-PCR.
6. Ứng dụng
Chẩn đoán tam bội phổ biến (NST 13, 18, 21) và dị bội NST giới tính ở cả giai đoạn trước sinh và sau sinh trong các trường hợp có yếu tố nguy cơ như:
- Xét nghiệm sàng lọc trước sinh nguy cơ cao bất thường lệch bội NST thường gặp.
- Bất thường trên siêu âm gợi ý liên quan rối loạn NST.
- Trẻ có dị tật bẩm sinh nghi ngờ bệnh rối loạn NST kể trên.
- Tiền sử mang thai hoặc sinh con mắc bệnh di truyền.
- Gia đình có tiền sử bệnh tật di truyền.
Nếu có bất cứ thắc mắc nào cần tư vấn và giải đáp liên quan đến kỹ thuật xét nghiệm QR-PCR cần được Bác sĩ Phương Hoa hỗ trợ, vui lòng liên hệ tại đây.
Bác sĩ Phương Hoa
Chuyên gia di truyền y học
Liên hệ với bác sĩ
Website này được xây dựng với mong muốn lan tỏa những thông tin hữu ích trong lĩnh vực di truyền học, trở thành kênh kết nối chuyên môn giữa các bác sĩ, chuyên gia y tế nhằm mang lại sự hỗ trợ tốt nhất cho người bệnh.
