PCR là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi ở nhiều lĩnh vực, trong đó có di truyền y học, chẩn đoán và điều trị ung thư, pháp y. Tìm hiểu thông tin về kỹ thuật là gì, có những ưu điểm, hạn chế và ứng dụng cụ thể như thế nào qua bài viết sau.
1. Giới thiệu chung
PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật sinh học phân tử được sử dụng để khuếch đại invitro đoạn phân tử DNA chọn lọc, nhằm tăng số lượng DNA ban đầu lên một lượng mong muốn. PCR được phát minh bởi nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis vào năm 1983, và chỉ gần một thập kỷ sau đó ông đã được trao giải Nobel Hóa học nhờ phát minh này. Sau gần 40 năm ra đời và phát triển, PCR hiện đang được ứng dụng rộng rãi trong y học và khoa học cơ bản.
2. Nguyên lý kỹ thuật và quy trình PCR
Nguyên lý kỹ thuật
Nguyên lý của kỹ thuật PCR là nhân bản in vitro đoạn DNA đích nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase.
Quy trình PCR
Thành phần của phản ứng PCR:
- DNA mẫu cần khuếch đại.
- Cặp mồi (primer): trình tự oligonucleotide có khả năng bắt cặp đặc hiệu với đầu 5’ hay đầu 3’ của đoạn DNA cần khuếch đại.
- DNA polymerase: enzym xúc tác cho việc kéo dài sợi DNA.
- dNTP: dATP, dGTP, dCTP, dTTP, là nguyên liệu cho DNA-polymerase tổng hợp DNA mới.
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho phản ứng PCR.
Phản ứng PCR thông thường gồm 25-35 chu kỳ nhiệt, mỗi chu kỳ nhiệt gồm 3 giai đoạn: Biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi.
- Giai đoạn biến tính: Giai đoạn biến tính xảy ra ở nhiệt độ 95°C, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bị phá vỡ, sợi DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn, tạo điều kiện cho các đoạn mồi gắn vào sợi DNA đơn.
- Giai đoạn gắn mồi: Giai đoạn gắn mồi xảy ra ở nhiệt độ 55°C- 65°C, đây là nhiệt độ thích hợp để các đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích.
- Giai đoạn kéo dài chuỗi: Ở giai đoạn này nhiệt độ được đưa lên 72°C, đây là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính của enzyme Taq polymerase, enzym này có vai trò xúc tác cho quá trình gắn các dNTP vào đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một sợi DNA ban đầu đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục n lần thì số bản sao DNA tạo ra là 2ⁿ bản sao.
3. Phân tích kết quả
Các kỹ thuật được sử dụng để phân tích các sản phẩm PCR được chia thành hai nhóm:
– Quá trình phân tích sản phẩm xảy ra trong phản ứng PCR: đối với realtime PCR, kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR. Kết quả khuếch đại được quan sát thông qua các tín hiệu huỳnh quang được giải phóng trong quá trình phản ứng PCR xảy ra. Các tín hiệu này được phát hiện và ghi lại dưới dạng biểu đồ, từ đó có thể đưa ra đánh giá về số lượng sản phẩm khuếch đại DNA đích có mặt ở mỗi chu kỳ.
– Phân tích sản phẩm sau phản ứng PCR: Có nhiều phương pháp phân tích sản phẩm PCR, gồm điện di trên gel, điện di mao quản, lai phân tử dot blots, …, trong đó điện di trên gel agarose là phương pháp được sử dụng phổ biến nhất. Phương pháp này phát hiện sản phẩm PCR dựa trên sự tích điện và kích thước đoạn DNA được khuếch đại.
Kỹ thuật điện di trên gel agarose sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều, một bản gel agarose đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử DNA, các chất nhuộm khác nhau (ethidium bromide, redsafe) để phát hiện vị trí các phân tử DNA trên gel sau khi điện di, và thang DNA chuẩn để đánh giá kích thước đoạn DNA khuếch đại. Trong môi trường tích điện, phân tử DNA (mang điện tích âm) di chuyển từ cực âm sang cực dương, các đoạn DNA có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, đoạn DNA có kích thước càng nhỏ di chuyển càng nhanh và ngược lại đoạn DNA có kích thước càng lớn di chuyển càng chậm. Kích thước của đoạn DNA khuếch đại được xác định bằng cách so sánh với thang DNA chuẩn.
3.1. Ưu điểm của kỹ thuật PCR
– Đơn giản và dễ thực hiện.
– Thời gian xét nghiệm nhanh và hiệu quả: PCR có thể khuếch đại một lượng nhỏ mẫu DNA thành hàng triệu bản sao chỉ trong vài giờ.
– Độ nhạy, độ đặc hiệu cao.
3.2. Hạn chế của kỹ thuật PCR
– PCR chỉ có thể phát hiện trình tự DNA đã biết: để thiết kế được cặp mồi cho phản ứng PCR cần có dữ liệu trình tự của đoạn DNA cần khuếch đại, do đó PCR chỉ có thể được sử dụng để xác định sự hiện diện hay vắng mặt của đoạn DNA nhất định.
– Nguy cơ ngoại nhiễm: PCR là kỹ thuật có độ nhạy cao, chỉ một lượng nhỏ DNA ngoại lai bị nhiễm vào mẫu bệnh phẩm ban đầu cũng có thể được khuếch đại, gây ảnh hưởng đến kết quả PCR.
– Gắn mồi không đặc hiệu: các đoạn mồi được sử dụng cho PCR có thể bắt cặp không đặc hiệu với các đoạn DNA có trình tự tương tự với DNA đích, làm giảm độ đặc hiệu của kết quả PCR.
4. Ứng dụng của xét nghiệm
4.1. Ứng dụng PCR trong chẩn đoán và sàng lọc bệnh lý di truyền
PCR hiện đang được ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền và sàng lọc phát hiện các trường hợp mang gen thể ẩn. Ngoài ứng dụng trong chẩn đoán bệnh lý di truyền sau sinh, PCR còn được ứng dụng trong chẩn đoán trước sinh nhằm phát hiện thai có lệch bội Nhiễm sắc thể (lệch bội NST 13, NST 18, NST 21, và NST giới), và chẩn đoán các rối loạn di truyền đơn gen (Thalassemia, bệnh Wilson, …).
4.2. Ứng dụng PCR trong chẩn đoán và điều trị ung thư
Hiện nay, PCR được ứng dụng phổ biến trong lĩnh vực ung thư với nhiều mục đích khác nhau, gồm sàng lọc nguy cơ ung thư di truyền, phát hiện sớm ung thư dựa vào các ctDNA (circulating tumor DNA) có nguồn gốc từ tế bào ung thư, tiên lượng và điều trị đích ung thư thông qua phát hiện các đột biến gen liên quan đến điều trị đích và kháng thuốc, theo dõi điều trị, và tái phát ung thư.
4.3. Ứng dụng PCR trong phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh nhiễm trùng
PCR cho phép phát hiện các tác nhân vi sinh vật gây bệnh một cách nhanh chóng và chính xác với độ nhạy, độ đặc hiệu cao mà không đòi hỏi phải tiến hành nuôi cấy. Bên cạnh đó, qPCR còn cho phép xác định tải lượng virus trong mẫu bệnh phẩm ban đầu, hỗ trợ cho việc tiên lượng và theo dõi điều trị. Các tác nhân vi sinh vật có thể phát hiện bằng xét nghiệm PCR bao gồm: Trực khuẩn lao, Virus viêm gan B, Viêm gan C, HPV, Herpes, HIV, ….
4.4. Ứng dụng PCR trong pháp y
Hiện nay, PCR cũng là một công cụ rất hiệu quả trong giám định pháp y để xác định danh tính nạn nhân, truy tìm và xác định thủ phạm qua các dấu vết sinh học để lại tại hiện trường hay trên nạn nhân, xác định quan hệ huyết thống qua xác định dấu vân tay DNA của các cá nhân và mối liên hệ huyết thống của các dấu vân tay DNA này, và xác định hài cốt lâu năm là thuộc gia đình nào có người thân bị mất tích.
Tài liệu tham khảo
- Wang M, Cai J, Chen J, et al. PCR Techniques and Their Clinical Applications. IntechOpen; 2023. doi:10.5772/intechopen.110220
- Ghannam MG, Varacallo M. Biochemistry, Polymerase Chain Reaction. In: StatPearls. StatPearls Publishing; 2023. Accessed June 4, 2023. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK535453/
- Garibyan L, Avashia N. Research Techniques Made Simple: Polymerase Chain Reaction (PCR). J Invest Dermatol. 2013;133(3):e6. doi:10.1038/jid.2013.1
Nếu có bất cứ thắc mắc nào cần tư vấn và giải đáp liên quan đến kỹ thuật PCR cần được Bác sĩ Phương Hoa hỗ trợ, vui lòng điền thông tin đăng ký tại đây.
Bác sĩ Phương Hoa
Chuyên gia di truyền y học
Liên hệ với bác sĩ
Website này được xây dựng với mong muốn lan tỏa những thông tin hữu ích trong lĩnh vực di truyền học, trở thành kênh kết nối chuyên môn giữa các bác sĩ, chuyên gia y tế nhằm mang lại sự hỗ trợ tốt nhất cho người bệnh.
