Giải mã trình tự gen Sanger (Sanger Sequencing) là phương pháp giải mã trình tự gen được sử dụng rất phổ biến trong hỗ trợ chẩn đoán, điều trị bệnh lý, cải thiện sức khỏe và nâng cao chất lượng cuộc sống. Tìm hiểu về kỹ thuật xét nghiệm này qua một số thông tin trong bài viết sau.
1. Xét nghiệm giải trình tự gen Sanger là gì?
Sanger Sequencing được đặt theo tên của người phát minh ra công nghệ đột phá này – Tiến sĩ Frederick Sanger. Ông là người đã phát triển phương pháp này vào giữa những năm 1970. Từ đó phương pháp để giải trình tự DNA dựa trên phương pháp PCR kết thúc chuỗi (chain termination) được coi là tiêu chuẩn vàng và sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực nghiên cứu bộ gen chức năng và tương quan với kiểu hình, di truyền tiến hóa và nghiên cứu bệnh phức tạp. Giải trình tự gen Sanger giúp khảo sát các đột biến điểm hoặc xóa/chèn đoạn nhỏ trên các đoạn DNA tương đối dài, khoảng 900-1200 cặp nucleotide.
2. Nguyên lý xét nghiệm giải trình tự gen Sanger
Trong giải trình tự Sanger, đoạn mồi DNA bổ sung cho DNA mẫu (DNA sẽ được giải trình tự) được sử dụng làm điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA. Với sự có mặt của bốn deoxynucleotide triphosphate (dNTPs: A, G, C và T), polymerase mở rộng đoạn mồi bằng cách thêm dNTP bổ sung vào chuỗi DNA mẫu. Để xác định nucleotide nào được kết hợp vào chuỗi nucleotide, bốn dideoxynucleotide triphosphate (ddNTP: ddATP, ddGTP, ddCTP và ddTTP) được đánh dấu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang riêng biệt được sử dụng để chấm dứt phản ứng tổng hợp. So với dNTPs, ddNTPs có một nguyên tử oxy bị loại bỏ khỏi ribonucleotide, do đó không thể tạo liên kết với nucleotide tiếp theo. Sau khi tổng hợp, các đoạn DNA thu được sẽ được điện di, do có kích thước khác nhau nên tốc độ điện di khác nhau nên phân tách được các đoạn DNA. Dựa vào kích thước của DNA và tín hiệu huỳnh quang của ddNTP mà trình tự của DNA mẫu được xác định
3. Quy trình xét nghiệm xét nghiệm giải trình tự gen Sanger
Phương pháp giải trình tự Sanger bao gồm 7 bước:
- (1) Tách DNA mẫu cần xét nghiệm
- (2) PCR khuếch đại DNA mẫu
- (3) Làm sạch sản phẩm PCR
- (4) Tổng hợp DNA gắn huỳnh quang
- (5) Làm sạch sản phẩm DNA gắn huỳnh quang
- (6) Điện di mao quản
- (7) Phân tích dữ liệu
4. Phân tích kết quả xét nghiệm giải trình tự gen Sanger
Đầu ra cho giải trình tự Sanger thường là sắc ký đồ. Sắc ký đồ thể hiện sự di chuyển của các sản phẩm giải trình tự được dán nhãn thông qua điện di mao quản. Huỳnh quang được phát hiện ở phần cuối của mao quản và cường độ tín hiệu từ bốn kênh màu, mỗi kênh đại diện một loại nucleotide, được vẽ trên trục y tương ứng với thời gian trên trục x. Từ tín hiệu này sẽ xác định trình tự nucleotide A,T,G,C trên chuỗi DNA. So sánh chuỗi trình tự của bệnh nhân với chuỗi DNA tham chiếu để xác định có sự thay đổi nucleotide không (đột biến), đột biến này ở dạng đồng hợp tử hay dị hợp tử. Từ đó đưa ra các kết luận để hỗ trợ chẩn đoán và điều trị.
5. Ưu điểm và giới hạn xét nghiệm giải trình tự gen Sanger
5.1. Ưu điểm
- Giải trình tự Sanger vẫn là hình thức giải trình tự DNA chính xác nhất.
- Là phương pháp tiêu chuẩn vàng để phát hiện chính xác các biến thể nucleotide đơn lẻ và các đoạn chèn/xóa nhỏ.
- Linh hoạt hơn để kiểm tra một biến thể đã xác định trước cho các thành viên còn lại trong gia đình.
- Tiết kiệm chi phí khi các mẫu đơn lẻ cần được xét nghiệm nhanh (ví dụ: xét nghiệm trước khi sinh hoặc xét nghiệm người mang gen bệnh trong khi mang thai).
- Ít phụ thuộc vào các công cụ tính toán hơn NGS.
- Trong một số trường hợp, để khảo sát các đoạn dài hơn (lên đến khoảng 1000bp), giải trình tự Sanger sẽ có ưu thế hơn so với NGS (một số công nghệ chỉ giải trình tự các đoạn ngắn).
5.2. Hạn chế
- Thông tin di truyền hạn chế cho 1 đoạn DNA nhất định.
- Không hiệu quả về mặt chi phí khi giải trình tự nhiều gen song song hoặc để giải trình tự cùng một vùng trong nhiều mẫu.
- Tỷ lệ khảm phát hiện được là trên 20%, do đó sẽ không phát hiện được tình trạng khảm thấp
- Có thể yêu cầu lượng DNA đầu vào lớn hơn NGS.
- Không xác định được các mất đoạn/lặp đoạn lớn
6. Ứng dụng xét nghiệm giải mã trình tự gen Sanger
- Trình tự chẩn đoán của một gen duy nhất.
- Xét nghiệm cho một biến thể trình tự gia đình cụ thể. Điều này có thể bao gồm:
- Xét nghiệm di truyền xác định tình trạng mang đột biến ở những người thân trực hệ trong gia đình đã có người mang đột biến gen. Ví dụ, bệnh nhân ung thư vú mang đột biến gen BRCA1, người thân trực hệ trong gia đình được xét nghiệm kiểm tra xem có mang đột biến này không.
- Xét nghiệm tình trạng mang gen ẩn ở bố mẹ khi trẻ mắc hội chứng đột biến gen lặn nhiễm sắc thể thường (ví dụ, bệnh bạch tạng).
- Xét nghiệm trước sinh cho các đột biến đã biết trong gia đình.
- Phân tích hỗ trợ giải thích khả năng gây bệnh của một biến thể (ví dụ: bằng cách xác định liệu một biến thể đang được khảo sát có xuất hiện ở anh chị em bị ảnh hưởng cũng như trong mẫu thử nghiệm hay không).
- Để xác nhận các biến thể được xác định bằng giải trình tự thế hệ mới (NGS).
- Để lấp đầy khoảng trống trong dữ liệu NGS.
Nếu có bất cứ thắc mắc nào cần tư vấn và giải đáp liên quan đến xét nghiệm giải mã trình tự gen Sanger cần được Bác sĩ Phương Hoa hỗ trợ, vui lòng điền thông tin đăng ký tại đây.
Bác sĩ Phương Hoa
Chuyên gia di truyền y học
Liên hệ với bác sĩ
Website này được xây dựng với mong muốn lan tỏa những thông tin hữu ích trong lĩnh vực di truyền học, trở thành kênh kết nối chuyên môn giữa các bác sĩ, chuyên gia y tế nhằm mang lại sự hỗ trợ tốt nhất cho người bệnh.
