Công nghệ droplet digital PCR cho phép đo lường hàng nghìn phản ứng khuếch đại độc lập trong 1 mẫu duy nhất. Công nghệ này cho phép sử dụng lượng mẫu và thuốc thử thấp hơn nên chi phí tổng thể giảm trong khi vẫn duy trì độ nhạy và chính xác cao.
1. Giới thiệu chung
Droplet Digital PCR hay còn gọi là phương pháp PCR kỹ thuật số sử dụng hệ thống vi giọt nhũ tương dầu-nước có chức năng tương tự như các ống nghiệm hay giếng phản ứng. Quá trình khuếch đại được xảy ra trong mỗi “giọt”. Phân vùng mẫu là chìa khóa của kỹ thuật này, mẫu được chia thành 20.000 giọt có kích thước nhỏ (nanolit) cho phép xảy ra hàng nghìn phản ứng khuếch đại độc lập trong một mẫu duy nhất.
2. Nguyên lý
Digital PCR được xây dựng dựa trên PCR truyền thống và phương pháp phát hiện dựa vào đầu dò huỳnh quang.
Bước quan trọng của kỹ thuật là quá trình phân chia mẫu trước khi khuếch đại bằng PCR. Mỗi phần mẫu sau phân chia có thể chứa hoặc không chứa phân tử đích, mỗi phần hoạt động như một phản ứng PCR riêng biệt. Đầu dò PCR được sử dụng để phát hiện các DNA đích khuếch đại. Mỗi phần (mỗi giọt) được phân tích sau PCR để xác định có hoặc không chứa chuỗi đích (dương tính/âm tính). Tỷ lệ mẫu dương tính (có chứa chuỗi đích)/ mẫu âm tính (không chứa chuỗi đích) là cơ sở để định lượng. Phân tích mẫu bằng phương pháp thống kê giúp định lượng tuyệt đối mẫu.
3. Quy trình thực hiện
- Chuẩn bị mẫu
DNA được tách chiết và chuẩn bị như đối với các phản ứng PCR thông thường. Lượng đầu vào của DNA được khuyến nghị là 100ng. Tuy nhiên tùy vào ứng dụng, xét nghiệm có thể cho kết quả với đầu vào là 10ng và tối đa là 350ng cho mỗi phản ứng.
- Phân chia mẫu
Hỗn hợp PCR được phân chia thành hàng nghìn giọt với kích thước rất nhỏ (nanolit) bằng công nghệ chuyên dụng. Các vi giọt được tạo thành trong nhũ tương dầu-nước để tạo các vách ngăn phân tách các phân tử DNA mẫu. Thay vì một phản ứng 20 μl, hiện nay có 20.000 phản ứng với 1 nl mỗi phản ứng. Sự phân chia này cho phép đo lường hàng nghìn sự kiện khuếch đại độc lập trong một phản ứng đơn lẻ.
- Khuếch đại mẫu (PCR)
Các vi giọt xảy ra quá trình khuếch đại DNA thông qua các chu trình nhiệt trong máy PCR, và phản ứng chỉ xảy ra trong những giọt chứa DNA mục tiêu. Phản ứng được thiết kế sao cho tất cả các giọt sẽ chứa các vật liệu tiêu chuẩn (enzym, mồi, mẫu dò).
- Đọc phản ứng
Sản phẩm PCR được phát hiện bằng mẫu dò Taqman là một đoạn oligo-nucleotide với đầu 5’ gắn một chất huỳnh quang (Reporter) và đầu 3’ còn lại gắn chất hấp thụ (quencher). Khi mẫu dò TaqMan còn nguyên vẹn, quencher sẽ hấp thụ tất cả ánh sáng huỳnh quang do reporter phát ra. Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bị Taq polymerase cắt bằng hoạt tính 5′ – 3′ exonuclease, reporter được giải phóng tín hiệu huỳnh quang không còn bị quencher hấp thu.
Các vi giọt được phân tích bằng đầu đọc huỳnh quang (một công cụ tương tự như máy đếm tế bào dòng chảy) để xác định tỷ lệ vi giọt dương tính trong mẫu ban đầu.
- Phân tích dữ liệu
Những dữ liệu sau đó được phân tích bằng thống kê Poisson để xác định nồng độ mẫu DNA mục tiêu trong mẫu ban đầu.
4. Phân tích kết quả
Hình 4. Biên độ huỳnh quang trong các giọt. Mỗi chấm tương ứng với một giọt hay một phản ứng. Dương tính (màu xanh) và âm tính (màu đen).
Phần mềm chuyên dụng được sử dụng để đặt ra ngưỡng huỳnh quang cho từng giọt để phân biệt dương tính và âm tính. Trong một số trường hợp có thể đặt lại ngưỡng hoặc đọc thủ công trong phần phân tích của phần mềm cho từng phản ứng. Kênh FAM dành cho vùng gen mục tiêu (ROI), kênh VIC cho vùng gen tham chiếu (REF). Phần mềm sẽ tự động tính toán và định lượng dựa trên tỷ lệ nồng độ ROI:REF.
5. Ưu điểm và giới hạn
- Ưu điểm:
+ Cho phép đo lường hàng nghìn sự kiện khuếch đại độc lập trong một phản ứng đơn lẻ so với một phép đo duy nhất như PCR truyền thống.
+ Kỹ thuật ddPCR cho phép sử dụng lượng mẫu và thuốc thử thấp hơn, đồng thời giảm chi phí tổng thể so với các phương pháp khác
+ Có khả năng định lượng số lượng tuyệt đối các bản sao DNA/RNA mục tiêu trên mỗi mẫu đầu vào mà không cần sử dụng các đường cong tiêu chuẩn với độ nhạy độ đặc hiệu cao, ít bị ảnh hưởng bởi chất ức chế phản ứng PCR.
+ Phù hợp với các ứng dụng đòi hỏi phải phát hiện một lượng nhỏ nucleic acid đầu vào. Định lượng mục tiêu hiếm trong mẫu phức tạp.
- Giới hạn:
+ Công suất xét nghiệm trung bình (thấp hơn Real-time PCR)
+ Thời gian trả kết có thể tối ưu hóa tuy nhiên vẫn lâu hơn Realtime – PCR
6. Ứng dụng của xét nghiệm
ddPCR mở rộng phạm vi phân tích nucleic acid vượt qua khả năng của các phương pháp khác trong một số ứng dụng:
– Sinh thiết lỏng (liquid biopsy) trong ung thư để phát hiện đột biến khi xuất hiện với tỷ lệ nhỏ: phát hiện ung thư sớm, phát hiện đột biến mới sớm trong điều trị và theo dõi ung thư, phát hiện tồn dư tối thiểu của khối u,…
– Phân tích CNV (Copy number variation)
– Phát hiện biến thể hiếm (SNP hoặc chuyển đoạn)
– Biểu hiện gen và phân tích miRNA
Tài liệu tham khảo
https://currentprotocols.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/0471142905.hg0724s82
https://bimetech.vn/digital-pcr.html
Trên đây là những thông tin tổng hợp về công nghệ droplet digital PCR. Nếu có thắc mắc cần bác sĩ Phương Hoa giải đáp, vui lòng liên hệ tư vấn tại đây.
Bác sĩ Phương Hoa
Chuyên gia di truyền y học
Liên hệ với bác sĩ
Website này được xây dựng với mong muốn lan tỏa những thông tin hữu ích trong lĩnh vực di truyền học, trở thành kênh kết nối chuyên môn giữa các bác sĩ, chuyên gia y tế nhằm mang lại sự hỗ trợ tốt nhất cho người bệnh.
