Công nghệ MLPA được đánh giá là “tiêu chuẩn vàng” trong xác định các đa hình số bản sao (CNV) có kích thước nhỏ chỉ trong 1 phản ứng. Công nghệ này được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền và ung thư.
1. Giới thiệu chung
MLPA (Multiplex Ligation – Dependent Probe Amplification) là phương pháp dựa trên kĩ thuật PCR nhằm phát hiện số lượng bản sao (CNV), phương pháp này cho phép phát hiện số lượng bản sao của tối đa 60 trình tự DNA trong một phản ứng. Ngoài ra, MLPA mở rộng cũng cho phép phát hiện các biến thể đơn Nucleotide (SNV) và tình trạng Methyl hóa.
2. Nguyên lý kỹ thuật
Kỹ thuật MLPA sử dụng các probe (đầu dò) bổ sung đặc hiệu với trình tự DNA đích. Bản chất của các đầu dò là các oligonucleotid, với cấu trúc gồm 2 phần tách biệt: đầu dò bên trái (left probe oligonucleotid – LPO) và đầu dò bên phải (Right probe oligonucleotid – RPO). Các LPO và RPO đều chứa trình tự DNA gắn mồi cho phản ứng PCR và trình tự lai với DNA đích, riêng RPO có thêm stuffer sequence – đảm bảo cho các sản phẩm MLPA có kích thước dài ngắn khác nhau.
3. Quy trình kỹ thuật:
Bước 1: Biến tính DNA và lai DNA đích với đầu dò
Ở bước này, sợi DNA đích được biến tính và ủ qua đêm với các đầu dò LPO và RPO. Kết thúc bước này, các LPO và RPO sẽ lai với sợi DNA đích ở các vị trí liền kề nhau.
Bước 2: Nối các đầu dò
Ở bước này, các LPO và RPO đã lai với sợi DNA đích ở các vị trí liền kề sẽ được nối với nhau để tạo thành 1 sợi oligonucleotid duy nhất bởi enzyme ligase. Bước này đòi hỏi độ đặc hiệu cao, đảm bảo không để bất kỳ sự sai lệch nào xung quanh vị trí nối xảy ra.
Bước 3: Khuếch đại
Sợi oligonucleotide được tạo thành ở bước 2 được khuếch đại bằng phản ứng Multiplex PCR. Chỉ những LPO và RPO nào đã nối với nhau mới được khuếch đại, những LPO và RPO không gắn với nhau sẽ bị rửa trôi.
Bước 4: Điện di mao quản phân tách sản phẩm
Sản phẩm PCR sẽ được đưa vào máy điện di mao quản để phân tách, quá trình phân tách dựa vào chiều dài khác nhau của sản phẩm PCR.
Bước 5: Phân tích kết quả
Dữ liệu sẽ được phân tích bằng phân mềm Coffalyser. Số lượng bản sao được xác định thông qua so sánh tỷ lệ chiều cao sản phẩm DNA đích/chiều cao của DNA tham chiếu (reference).
4. Ưu điểm, nhược điểm của kỹ thuật MLPA
Ưu điểm:
- MLPA là phương pháp có độ nhạy, độ đặc hiệu và độ chính xác cao, được xem là tiêu chuẩn vàng trong phát hiện các đa hình số bản sao (CNV) có kích thước nhỏ (mất hoặc lặp exon), nằm ngoài giới hạn phát hiện của các kỹ thuật khác như FISH, CMA, CNVseq.
Nhược điểm:
- Chi phí xét nghiệm cao.
- Số lượng CNV phát hiện trong một xét nghiệm là hạn chế, do đó thường chỉ áp dụng trong trường hợp đã định hướng được gen cần khảo sát.
5. Ứng dụng của kỹ thuật MLPA
Ứng dụng của kỹ thuật MLPA trong chẩn đoán bệnh di truyền
MLPA hiện đang được ứng dụng chủ yếu trong chẩn đoán các bệnh lý di truyền gây ra do mất/lặp đoạn exon, gồm bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (MLPA 79 exon trên gen DMD), loạn dưỡng cơ Becker, Teo cơ tủy SMA, Charcot-Marie-Tooth (CMT), α-Thalassemia do đột biến mất/lặp đoạn hiếm gặp, …
Ứng dụng của kỹ thuật MLPA trong ung thư
Ba ứng dụng chính của xét nghiệm MLPA trong lĩnh vực ung thư gồm: phát hiện đột biến mất/lặp đoạn trên các gen liên quan đến ung thư di truyền; phát hiện mất/lặp đoạn trên các gen liên quan đến sự tiến triển của bệnh và đáp ứng với điều trị trong tế bào sinh dưỡng (soma); xác định tình trạng methyl hóa các gen ức chế sinh ung thư.
Tài liệu tham khảo
- https://www.mrcholland.com/technology/mlpa/technique
- https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3317712/
Trên đây là thông tin tổng hợp về công nghệ MLPA. Nếu có bất cứ thắc mắc nào cần bác sĩ Phương Hoa tư vấn, hỗ trợ, vui lòng liên hệ tại đây.
Bác sĩ Phương Hoa
Chuyên gia di truyền y học
Liên hệ với bác sĩ
Website này được xây dựng với mong muốn lan tỏa những thông tin hữu ích trong lĩnh vực di truyền học, trở thành kênh kết nối chuyên môn giữa các bác sĩ, chuyên gia y tế nhằm mang lại sự hỗ trợ tốt nhất cho người bệnh.
