Kỹ thuật Real time PCR có thời gian thực hiện nhanh, độ nhạy và tính đặc hiệu cao hơn so với PCR. Kỹ thuật này hiện được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như chẩn đoán bệnh, di truyền y học, phát hiện ung thư, tìm tác nhân gây bệnh… Tìm hiểu về Real time PCR trong bài viết sau đây.
1. Giới thiệu chung
Khuếch đại là mục tiêu chính của bất kỳ phản ứng PCR nào. Sử dụng dNTP, mồi và đệm phản ứng PCR, Taq DNA polymerase sẽ khuếch đại DNA trong ống nghiệm
Trong phương pháp PCR truyền thống sau khi khuếch đại, các sản phẩm PCR được chạy trên gel agarose để phát hiện sự hiện diện hay vắng mặt của quá trình khuếch đại DNA. Nhưng trong real-time PCR lượng khuếch đại được đo ngay sau mỗi chu kỳ PCR.
2. Nguyên lý
Real time PCR được thực hiện theo cách tương tự như các xét nghiệm dựa trên PCR thông thường (biến tính DNA sợi kép sau đó ủ và kéo dài mồi). Sự khác biệt của real time PCR dựa trên việc sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc đầu dò gắn huỳnh quang liên kết với mẫu mục tiêu. Thông qua máy quét cường độ huỳnh quang, mẫu được định lượng.
Có 2 phương pháp định gắn huỳnh quang sử dụng trong real-time PCR
Thuốc nhuộm liên kết DNA
Thuốc nhuộm SYBR liên kết với DNA sợi kép nhưng không liên kết với DNA sợi đơn. Khi thuốc nhuộm liên kết với DNA sợi đôi, huỳnh quang do thuốc nhuộm phát ra sẽ tăng gấp 100 đến 1000 lần so với tín hiệu ban đầu. Tuy nhiên, huỳnh quang thuốc nhuộm ban đầu được lấy làm đường cơ sở để phát hiện. Phương pháp này nhanh chóng, đáng tin cậy và tiết kiệm chi phí. Tuy nhiên, thuốc nhuộm có thể liên kết với đoạn DNA không đặc hiệu tạo ra tín hiệu huỳnh quang
Đầu dò gắn huỳnh quang
Đầu dò TaqMan sử dụng hoạt động exonuclease 5′ của enzyme Taq Polymerase để đo lượng trình tự đích trong mẫu. Các mẫu dò TaqMan bao gồm một mẫu dò oligonucleotide 18-22 bp được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang báo cáo ở đầu 5′ và chất khử huỳnh quang ở đầu 3′. polymerase tiến hành kéo dài đoạn mồi và sao chép khuôn mẫu mà TaqMan® được gắn vào. Hoạt động exonuclease 5′ của polymerase cắt mẫu dò, giải phóng phân tử gắn huỳnh quang ra khỏi vùng lân cận gần của chất khử huỳnh quang. Kết quả là cường độ huỳnh quang tăng lên. Quá trình này lặp lại trong mỗi chu kỳ và không can thiệp vào quá trình tích lũy sản phẩm PCR.
3. Quy trình xét nghiệm
Giống như PCR thông thường, có ba bước chính trong real time PCR
(1) Biến tính
(2) Gắn mồi
(3) Tổng hợp chuỗi
Quá trình biến tính xảy ra ở 94°C trong đó DNA sợi kép bị biến tính và hai DNA sợi đơn được tạo ra.
Quá trình gắn mồi xảy ra ở 55°C đến 66°C, trong đó đoạn mồi đặc hiệu theo trình tự liên kết với DNA sợi đơn. Cùng với nó, thuốc nhuộm huỳnh quang hoặc mẫu dò cũng liên kết với chuỗi DNA.
Sự tổng hợp chuỗi xảy ra ở 72°C tại đó Taq DNA polymerase được kích hoạt cao nhất. Trong bước này, Taq thêm dNTP vào chuỗi DNA đang được tổng hợp.
4. Phân tích kết quả
Bằng cách so sánh giá trị Ct (điểm mà huỳnh quang có thể đo được) của cả mẫu chuẩn và mẫu chưa biết, đồ thị đường cong tuyến tính được tạo ra. Đối với mỗi độ pha loãng đã biết và chưa biết, Ct của tất cả được vẽ trên biểu đồ và bằng cách so sánh dữ liệu, nồng độ ban đầu của mẫu chưa biết được xác định.
Ct: Điểm mà tại đó huỳnh quang có thể đo được.
Baseline: Điểm khuếch đại ban đầu nơi huỳnh quang gần như bằng không
Threshold: Ngưỡng phân biệt tín hiệu khuếch đại với tín hiệu nền
Exponential phase: Giai đoạn tại đó mức khuếch đại được báo cáo là ở đỉnh cao nhất.
Đối với mẫu không có mẫu chuẩn thì có thể định lượng tương đối bằng phương pháp “Double Delta Ct” hoặc phương pháp Pffafl.
5. Ưu điểm và giới hạn
5.1. Ưu điểm
Tiết kiệm chi phí do không sử dụng rất nhiều hóa chất khác và không cần điện di trên gel agarose.
- Tiết kiệm thời gian: Thời gian trung bình cho phản ứng PCR cùng với điện di trên gel agarose và diễn giải dữ liệu là khoảng 4 đến 4,5 giờ. Ngược lại, real time PCR cho kết quả trong thời gian nhanh. Thời gian trung bình của phản ứng real time PCR là khoảng 30 phút đến 2 giờ.
- Độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn: mẫu dò và mồi có tính đặc hiệu cao đối với trình tự, nhưng nếu có bất kỳ liên kết không đặc hiệu nào xảy ra, nó sẽ được theo dõi ngay lập tức trong quá trình phản ứng.
- Yêu cầu ít mẫu hơn: Thử nghiệm tổng thể yêu cầu ít vật liệu tiêu bản hơn. Nó cần ít hơn 1000 lần DNA hoặc RNA mẫu để phản ứng xảy ra so với PCR thông thường.
- Ưu điểm chính so với kỹ thuật PCR khác là định lượng DNA hoặc RNA mục tiêu có trong mẫu.
5.2. Giới hạn
- Thiết bị đắt hơn so với PCR thông thường.
- Xét nghiệm không có sẵn cho tất cả các loại gen và bất thường, cần thiết kế mồi riêng cho mỗi loại đột biến.
- Cần có chuyên môn và kỹ năng kỹ thuật cao hơn để phát triển một xét nghiệm.
6. Ứng dụng của PCR
- Chẩn đoán bệnh: Real time PCR được sử dụng trong chẩn đoán bệnh đơn gen và bệnh đa gen. Nó được sử dụng để định lượng gen bị đột biến ở bệnh nhân mắc bệnh. Real time PCR thậm chí còn được sử dụng để xác định sự thay đổi số lượng bản sao trong các mô khác nhau đối với các rối loạn di truyền khác nhau.
- Phân tích microRNA: MicroRNA là các phân tử RNA nhỏ hơn có chiều dài từ 20 đến 25 nucleotide. Nó đóng một vai trò quan trọng trong con đường điều hòa gen. Xét nghiệm real time PCR được sử dụng để định lượng microRNA từ các mô khác nhau. Bằng cách định lượng nó, chúng ta có thể ước tính mức độ biểu hiện gen trong các mô khác nhau chịu ảnh hưởng của microRNA.
- Phát hiện ung thư: Các tế bào khối u chứa mRNA đột biến sẽ vận chuyển đến các mô khác nhau nếu nó ác tính. Bằng cách định lượng tổng số mRNA chống lại mRNA đột biến vào các mẫu ung thư hoặc từ tế bào ung thư. Giai đoạn ung thư có thể được xác định. Theo đó mức độ nghiêm trọng của ung thư biểu mô có thể được ước tính. mRNA đột biến là dấu ấn sinh học tốt nhất cho các nghiên cứu biểu hiện gen đối với bệnh ung thư. Hơn nữa, định lượng có thể hữu ích trong việc đo lường sự phục hồi trong điều trị ung thư. Sau mỗi liệu pháp, mức độ biểu hiện gen của gen ung thư đột biến từ các mô bị ảnh hưởng được xác định.
- Kiểm tra tải lượng vi sinh vật: Tải lượng vi sinh vật trong mẫu lên men, mẫu đất, mẫu nước, thực phẩm và sự hư hỏng của thực phẩm có thể được ước tính chính xác bằng Real time PCR.
- Xác định kiểu gen và định lượng mầm bệnh: Nhiễm vi sinh vật là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây tử vong và bệnh tật trên toàn thế giới. Không giống như PCR thông thường (chỉ có thể phát hiện một hoặc một số chủng và kiểu gen), RT-PCR có thể định lượng mức độ lây nhiễm và đo lường vi khuẩn có trong mẫu.
- Định danh và định lượng axit nucleic tuần hoàn: DNA tự do thai nhi và RNA vi mô tuần hoàn là hai loại axit nucleic tuần hoàn có trong máu. Cả hai loại axit nucleic đều có mặt với số lượng rất ít. mRNA lưu hành là dấu hiệu tốt nhất để chẩn đoán ung thư. Chẩn đoán trước sinh một số rối loạn di truyền đối với DNA tự do của thai nhi
Tài liệu tham khảo
https://microbeonline.com/real-time-pcr-principles-and-applications/
Nếu có bất cứ thắc mắc nào cần tư vấn và giải đáp liên quan đến kỹ thuật xét nghiệm Real time PCR cần được Bác sĩ Phương Hoa hỗ trợ, vui lòng điền thông tin đăng ký tại đây.
Bác sĩ Phương Hoa
Chuyên gia di truyền y học
Liên hệ với bác sĩ
Website này được xây dựng với mong muốn lan tỏa những thông tin hữu ích trong lĩnh vực di truyền học, trở thành kênh kết nối chuyên môn giữa các bác sĩ, chuyên gia y tế nhằm mang lại sự hỗ trợ tốt nhất cho người bệnh.
