Lai huỳnh quang tại chỗ FISH hay xét nghiệm FISH thường được sử dụng trong chẩn đoán các bất thường nhiễm sắc thể trước sinh cũng như phân loại, tiên lượng một số loại ung thư. Ưu điểm của xét nghiệm này là cho kết quả nhanh, đặc hiệu, chính xác. Tìm hiểu về kỹ thuật xét nghiệm FISH trong bài viết sau đây.
1. Lai huỳnh quang tại chỗ FISH là gì?
FISH (Fluorescence in situ hydridization) hay kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ, là kỹ thuật trung gian giữa xét nghiệm di truyền tế bào và xét nghiệm di truyền phân tử. Kỹ thuật FISH sử dụng một đoạn mồi đặc hiệu (probe) có gắn tín hiệu huỳnh quang bổ sung với trình tự DNA đích, để phát hiện sự có mặt hoặc vắng mặt của một đoạn gen nào đó trên nhiễm sắc thể (NST).
2. Nguyên lý kỹ thuật
Kỹ thuật FISH dựa trên khả năng lai giữa DNA sợi đơn với đoạn DNA mồi đặc hiệu (probe) được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang. Đoạn DNA đích được cố định trên bề mặt tiêu bản, biến tính, và lai ở điều kiện thích hợp với probe tạo thành chuỗi DNA xoắn kép. Sau quá trình lai, sản phẩm được khảo sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, sự có mặt hay vắng mặt của tín hiệu huỳnh quang giúp đánh giá có hay không có sự hiện diện của vùng nhiễm sắc thể cần khảo sát tương ứng.
3. Quy trình thực hiện lai huỳnh quang tại chỗ FISH
3.1. Bước 1: Chuẩn bị tiêu bản:
- Các tế bào kỳ trung gian (interphase) hoặc kỳ giữa (metaphase) được dàn đều và cố định lên lam kính. Nếu sử dụng kỹ thuật FISH trên các tế bào metaphase thì cần nuôi cấy và chuẩn bị tiêu bản như kỹ thuật xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ. Trong trường hợp sử dụng tế bào interphase thì có thể bỏ qua bước nuôi cấy. Thao tác cố định cần đảm bảo mật độ tế bào trên lam kính ở mức vừa phải, các cụm nhiễm sắc thể kỳ giữa to và bung đẹp.
- Dùng bút kim cương đánh dấu ở mặt dưới tiêu bản những vùng đáp ứng được yêu cầu trên. Sau khi cố định tế bào, cần kiểm tra lại mật độ tế bào dưới kính hiển vi.
3.2. Bước 2: Rửa tiêu bản:
- Rửa tiêu bản bằng dung dịch 2x SSC và formaldehyde.
- Khử nước bằng cồn 70o, 85o và 100o.
3.3. Bước 3: Biến tính và Lai:
- Nhỏ dung dịch có chứa probe vào vị trí đánh dấu trên tiêu bản sau đó phủ vị trí này bằng coverslip (phiến kính). Yêu cầu: Dung dịch probe thấm đều trên tiêu bản, không có bọt khí.
- Đặt tiêu bản vào máy lai, biến tính ở 65oC – 70oC trong 5 phút, hạ dần nhiệt độ xuống 37oC và ủ trong buồng tối, ẩm ở nhiệt độ này qua đêm (thường 16 giờ).
3.4. Bước 4: Rửa tiêu bản sau khi lai và cố định màu bằng DAPI:
- Rửa tiêu bản nhiều lần bằng dung dịch SSC.
- Phủ DAPI lên bề mặt tiêu bản để chống mất màu probe và nhuộm nhân tế bào.
3.5. Bước 5: Phân tích kết quả:
Kết quả FISH được phân tích dưới kính hiển vi huỳnh quang.
4. Cách phân tích kết quả lai huỳnh quang tại chỗ FISH
Yêu cầu với tiêu bản FISH phân tích:
- Nền tiêu bản sạch, không có cặn probe tồn dư
- Ranh giới nhân còn rõ
- Các tín hiệu huỳnh quang rõ nét
Nên chọn vùng nhân đơn độc, ít chồng lấp để đánh giá. Mỗi probe sẽ quan sát thấy trên kính hiển vi huỳnh quang tương ứng với một tín hiệu màu huỳnh quang nhất định. Tùy theo yêu cầu xét nghiệm (xác định lệch bội, vi mất đoạn, chuyển đoạn) để có hình thức đánh giá phù hợp.
5. Ưu và nhược điểm của lai huỳnh quang tại chỗ FISH
5.1. Ưu điểm
- Độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
- Thời gian xét nghiệm nhanh: Thời gian tiến hành kỹ thuật FISH trung bình là 48h, ngắn hơn rất nhiều so với xét nghiệm nhiễm sắc thể đồ (7-10 ngày).
- Kỹ thuật đơn giản, không cần nuôi cấy tế bào, dễ phân tích kết quả: kỹ thuật FISH có thể tiến hành trên cả tế bào chưa qua nuôi cấy và tế bào đã nuôi cấy, kỹ thuật xét nghiệm và phân tích kết quả tương đối đơn giản.
5.2. Nhược điểm
Giới hạn lớn nhất của kỹ thuật FISH là chỉ phát hiện các bất thường NST đặc hiệu đã biết, và số lượng bất thường có thể phát hiện bằng kỹ thuật FISH là tương đối hạn chế, do hạn chế về số lượng probe hiện có.
6. Ứng dụng của lai huỳnh quang tại chỗ FISH trong y học
6.1.Ứng dụng của FISH trong chẩn đoán các bất thường di truyền
Phát hiện bất thường số lượng NST trong chẩn đoán trước sinh
Interphase FISH được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán trước sinh để phát hiện nhanh các bất thường số lượng NST thường gặp (13, 18, 21, X, Y). Ưu điểm của interphase FISH so với xét nghiệm tế bào truyền thống NST đồ là có thể thực hiện trên tế bào chưa qua nuôi cấy nên thời gian xét nghiệm nhanh (24h-48h), cũng như giảm được các rủi ro của nuôi cấy như nhiễm khuẩn, một số dòng tế bào mọc ưu thế, và xác định tỷ lệ khảm chính xác hơn, kể cả tỷ lệ khảm thấp do khảo sát trên một số lượng lớn tế bào.
Phát hiện các vi mất đoạn trong các hội chứng di truyền
Hiện nay, FISH đang được ứng dụng rộng rãi trong phát hiện các vi mất đoạn liên quan đến các hội chứng di truyền thường gặp như hội chứng Prader-Willi/Angelman (mất đoạn nhỏ trên NST số 15q11), hội chứng DiGeorge (mất đoạn nhỏ trên NST số 22q11), hội chứng William (mất đoạn nhỏ trên NST số 7q11), hội chứng Criduchat (mất đoạn nhỏ trên NST số 5p), … với độ nhạy và độ chính xác cao. Ưu điểm của FISH so với NST đồ là có khả năng phát hiện các mất đoạn có kích thước < 5Mb.
Phát hiện các nhiễm sắc thể chưa rõ nguồn gốc (Marker)
Marker là các cấu trúc di truyền bất thường, thường có kích thước nhỏ và không thể xác định nguồn gốc bằng kỹ thuật tế bào học truyền thống. Kỹ thuật FISH cho phép phát hiện nguồn gốc các Marker này, tuy nhiên, do số lượng probe hạn chế, FISH chỉ phát hiện được nguồn gốc của Marker mà không xác định được chính xác kích thước và thành phần cấu trúc của nó.
6.2. Ứng dụng của FISH trong ung thư
Kỹ thuật FISH có khả năng phát hiện các bất thường NST đặc hiệu trong một số loại ung thư như bệnh bạch cầu cấp, u nguyên bào thần kinh, ung thư vú, …
- Bệnh bạch cầu cấp: FISH có khả năng phát hiện một số chuyển đoạn đặc hiệu liên quan đến bệnh bạch cầu cấp như chuyển đoạn nhiễm sắc thể số 9 và 22, số 4 và 11, số 8 và 21… qua đó có giá trị trong phân loại và tiên lượng điều trị bệnh.
- U nguyên bào thần kinh: FISH có khả năng phát hiện các bất thường NST liên quan đến u nguyên bào thần kinh như lặp đoạn của gen NMYC, mất đoạn trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể số 1, và thêm đoạn trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 7… qua đó có giá trị trong phân loại và tiên lượng điều trị bệnh.
- Ung thư vú: Khoảng 20% – 30% các trường hợp ung thư vú ở người phát hiện có sự biểu hiện quá mức của HER2. Mức độ biểu hiện gen HER2 đóng vai trò quan trọng trong tiên lượng và điều trị đích ung thư vú. Hiện nay, kỹ thuật FISH được xem là tiêu chuẩn vàng trong đánh giá mức độ biểu hiện gen HER-2, qua đó có giá trị trong tiên lượng và điều trị đích ung thư vú.
Nếu có bất cứ thắc mắc nào cần tư vấn và giải đáp liên quan đến lai huỳnh quang tại chỗ FISH hay còn gọi xét nghiệm FISH cần được Bác sĩ Phương Hoa hỗ trợ, vui lòng liên hệ tại đây.
Bác sĩ Phương Hoa
Chuyên gia di truyền y học
Liên hệ với bác sĩ
Website này được xây dựng với mong muốn lan tỏa những thông tin hữu ích trong lĩnh vực di truyền học, trở thành kênh kết nối chuyên môn giữa các bác sĩ, chuyên gia y tế nhằm mang lại sự hỗ trợ tốt nhất cho người bệnh.
